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食品中殘留物定性首選色譜-質譜聯用技術

  新的《中華人民共和國食品安全法》(以下簡稱《食安法》)已于2015年10月1日正式實施了。

  有專家說,新《食安法》是我國為食品安全制定的最嚴格的一部法律。《食安法》第三條明確指出:“食品安全工作實行預防為主、風險管理、全程控制、社會共治,建立科學、嚴格的監督管理制度。”《食 安法》中列明了影響食品安全的項目,包括這樣一些內容:致病性微生物、農藥殘留、獸藥殘留、生物毒素、重金屬等污染物質以及其他危害人體健康的物質。這些物質的甄別要靠“按照國家有關認證認可規定取得資質認定”的食品檢測實驗室檢測(《食安法》第八十四條)。第八十五條中又規定“食品檢驗由食品檢驗機構指定的檢驗人獨立進行。檢驗人應當依照有關法律、法規的規定,并按照食品安全標準和檢驗規范對食品進行檢驗,尊重科學,恪守職業道德,保證出具的檢驗數據和結論客觀、公正,……”。保證檢驗數據客觀、公正,用分析方法學解釋就是數據準確。當前國家規定食品中需要檢測的有機有害物質約600種,它包括:殘留農藥、殘留獸藥、食品添加劑(包括GB 2760以外的非法添加物)、環境污染物、生物毒素(因為許多生物毒素,如黃曲霉毒素等,檢測方法與有機有害物質相同,通常也遵照有機物分析結果的判定方法執行)等,對于上述被測物質分析結果數據準確是指定性和定量準確。

  怎樣的數據算是準確呢?下面以殘留農藥分析為例,通過對其分析檢測的發展歷史,來了解色譜-質譜聯用技術在當今食品衛生項目檢測中具有的重要地位。

  二十世紀四十年代滴滴涕農藥問世,化學農藥開始大量使用。

  六十年代歐洲等國發現,有機氯農藥難以降解而污染環境,并通過殘留在農產品中進入人類的食物鏈,對人類健康產生不良影響,提出了農藥殘留概念,開始了對食品(這里的食品是大食品概念,包括初級農產品和加工食品)中殘留農藥的分析檢測。

  八十年代我國改革開放初期,向發達國家出口的食品是當時主要換取外匯的商品之一。為了滿足國外對食品中農殘限量的要求,當時的進出口商品檢驗局開始檢測農殘,主要項目是六六六和滴滴涕。六六六和滴滴涕都是含氯農藥,各有四個空間異構體,檢測時加上內標物環氧七氯,共檢測9個物質。分析采用氣相色譜-電子俘獲檢測器(GC-ECD)檢測,色譜柱采用填充柱。由于色譜法定性是靠保留時間,只有2M長的填充柱要想獲得對被測物良好的分離效果,需選擇特定擔體和不同配比固定液。那時每一個方法檢測的農藥多為一種或一組幾個性質相似的農藥,色譜柱是專用的,前處理也具有很強的針對性,否則在實際檢測時,加上基質干擾,就可能影響定性、定量結果。

  九十年代,彈性石英毛細管色譜柱商品化,這個技術大大提高了色譜柱的分離能力和峰容量,使一個方法一次檢測農藥的數量增加到了30多個,而且對化合物分析的適用性更廣了。但利用色譜保留時間定性,對于基質復雜樣品中農殘定性仍然是一個難題,而且檢測的農藥種類多了,前處理操作更加復雜,耗時更長,否則很難同時達到方法學規定的回收率和重現性。當時絕大多數實驗室還沒有財力配置色譜-質譜聯用儀,所以推出了一個雙柱定性方法,即:不同化合物在不同固定相上的保留時間大多數情況下是不一樣的,利用這一原理,如果懷疑是陽性檢出,再用另一根不同極性的毛細管色譜柱再檢測一遍,如果這時被測物的保留時間仍然與農藥標準品一樣,就視為檢出。這種方法不僅麻煩,而且定性還是只有保留時間而沒有化合物的分子信息。

  九十年代中期,毛細管氣相色譜與小型臺式四極桿質譜儀聯用技術逐漸成熟,商品儀器價格不斷降低,越來越多的食品實驗室開始配備氣相色譜-質譜聯用儀(GC-MS)。當時發達國家對食品中要求檢測的農殘項目也增加到200多種。這么多需要檢測的項目,再靠傳統的色譜法一個一個或幾個幾個農藥的檢測已經無法滿足對食品衛生項目的監控要求了。為應對檢驗新需求,歐盟公共衛生實驗室(荷蘭)推出了第一個利用GC-MS技術檢測食品中130多種殘留農藥方法,改變了傳統農藥殘留檢測模式,即:先采用 GC-MS對樣品進行篩查式檢測,當發現疑似檢出農藥時,再用針對性的分析方法對可疑物進一步定性確證和定量。在世界糧農組織/世界衛生組織(FAO /WHO)《食品法典》2000版(CODEX ALIMENTARIUS COMMISSION, PESTICIDE RESIDUES IN FOOD, Methods of analysis and sampling, second edition, 2000)中列明需檢測的殘留農藥為197項。同時,法典首次規定了對檢出的農藥要用MS進行定性,并對GC-MS定性做了詳細的規定,即:首先考慮用MS的全掃描(Full scan)方式檢測,對比被測物與標準品二者的質譜圖是否一致。當全掃描檢測靈敏度達不到限量要求時,可采用選擇離子(SIM)方式檢測,SIM方式定性必須同時滿足三個條件:第一,被測農藥的保留時間值與對應標準品的保留時間值一致;第二,所選擇的多個特征離子必須同時存在;第三,所選離子間的豐度比與濃度相近的對應標準品一致。質譜給出的是化合物的分子信息,所以比只有保留時間的色譜定性能力有了本質飛躍。由于色譜-質譜聯用技術檢測能夠同時得到化合物多個信息而有更好的定性能力,對樣品前處理的要求也降低了,從而使整個分析的效率提高了。

  在質譜、核磁、紅外三大定性譜中,質譜的檢測靈敏度最高,響應速度最快,能與毛細管氣相色譜儀和超高效液相色譜儀很好的匹配。隨著現代質譜儀器性能的不斷提高,各種質譜組合增強功能的推出和整體價格的不斷降低,應用色譜-質譜技術對食品中殘留物分析所表現出來的優勢是其它任何技術所不具備的,色譜-質譜技術已經成為食品中殘留物分析最重要的技術手段,不是之一!歐盟在為動物源食品中殘留獸藥和食品中殘留農藥監控計劃推出的《執行關于96/23/EC指令分析方法程序和結果解釋的歐盟委員會2002 /657/EC指令》、《食品和飼料中農藥殘留分析質量控制和驗證程序SANCO/12571/ 2013指令》,對色譜-質譜定性、定量制定了詳細的方法學技術規范,成為當前做食品中殘留物分析實驗室管理和檢測人員必念的“經”。我國也以國際上先進的技術標準和指令為依據,結合我國國情,制定了《GB/T 27404—2008,實驗室質量控制規范 食品理化部分》標準,為分析檢測程序和結果判定提供了技術依據。我國現在有《GB 2763—2014,食品中農藥殘留最大限量》、《GB 2760—2014,食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》和《農業部公告禁用獸藥目錄》等標準和法規,對食品衛生指標都有嚴格規定,違反這些規定就是違法,按照新《食安法》對違反該法律規定 的行為要進行相應處罰,直至追究直接負責的主管人員和其他直接責任人員的法律責任。所以說,實驗室提供的檢測數據具有法律效力,數據必須準確無誤,避免因 數據的錯誤而冤枉了一個好人,毀了一個企業。

  前面提到的指令和標準有很完善科學的方法學理論作為技術支撐,嚴格按照標準程序操作和方法 學規定計算得到的檢測結果,無論是在國內,還是國際都是被認可和接受的。本文結合指令和標準中的規定,就實際應用色譜-質譜聯用技術檢測食品中殘留物定性 時應注意的一些問題和檢測結果數據判定的典型步驟歸納如下。

一、定性分析需要滿足的最基本條件

  食品中殘留物分析多為目標化合物檢測,出具的最終結果報告包括定性和定量內容,因此實驗前都要找到對應的標準物質,特別是用液相色譜-四極桿串聯質譜 (LC-MS/MS)分析,要用標準品對儀器參數進行優化。對檢測結果首先要定性準確,接下來定量分析才有意義。什么樣的定性分析結果是可以接受的呢?根 據上述兩個歐盟指令和國標的規定,要認真選擇和預設相關參數,核對這樣一些最基本數據:

  1.色譜的保留時間。前文中雖提 到單一的色譜保留時間值定性是不準確的,但在色譜-質譜聯用時仍然可以作為一個重要的定性參數。被測物與對應標準品之間保留時間允許偏差,在 2002/657/EC中規定GC的允差為 ±0.5%,LC的允差為 ±2.5%,在SANCO/12571/2013中規定的允差為 ±0.2min。在比對保留時間時有一個問題要注意,就是不同基質可能對保留時間會有影響。當被測物與對應標準品之間保留時間偏差在允差附近時,要考慮一 下是不是因為基質不同而影響到保留時間時超出允差。可以用兩種方法進一步確定一下:一是用相同基質的空白提取液配置標準品液,二是在被測樣品液中添加標準 液。

  2.當質譜全掃描檢測模式的靈敏度能滿足檢測限量要求時,應該首選全掃描模式檢測,這時可以得到被測化合物完整的分子信息。在 全掃描模式檢測時,要注意這樣幾個問題:一是標準品與被測物進行質譜圖的比對時,條件越接近越好,如,基質相同,濃度相近;二是要仔細扣除背景光譜,無論 是手動或自動,通過反褶積(去卷積)或其他算法,確保所得到色譜峰的質譜圖是典型的。當使用背景校正時,必須在批處理中統一地應用一種方法;三是在做目標 化合物檢測時,合理選擇掃描的質量范圍,一般低端從 m/z 50開始,但若有小于 m/z 100的離子非常強,且不是很重要時,可以從 m/z 100開始,高端到化合物分子量 + m/z 20(或50)。

  3.當全掃描檢測模式的靈敏度無法滿足檢測限量要求時,可以采用選擇離子模式(SIM)、反應監測模式(SRM)或多反應監測模式(MRM)檢測。農獸藥殘留分析基本上都是采用這幾種檢測模式。通常SIM、SRM、MRM檢測模式比全掃描模式的檢測靈敏度高約2個數量級以上。

  4.采用SIM、SRM或MRM定性檢測時要同時滿足三個條件:

  (1)被測物質與對應標準的所有選擇離子色譜圖有相同RT值;

  (2)分析中所有選擇離子應在相同RT時間窗口同時出現;

  (3)被測物質與對應標準(最好與被測物濃度和基質相近)的選擇離子之間有相同峰度比。

  5.殘留獸藥被測物離子選擇的規定:禁用獸藥識別點數≥4;限用獸藥識別點數≥3。這一規定可以擴展對所有食品中殘留有害物檢測。2002/657/EC中常見MS技術離子類型與識別點數的關系見下表:

MS技術每種離子的識別點
低分辨質譜(LRMS)1.0
LR-MSn前體離子1.0
LR-MSn產物離子1.5
高分辨質譜(HRMS)2.0
HR-MSn前體離子2.0
HR-MSn產物離子2.5

  6.SANCO/12571/2013中規定用GC-MS-SIM檢測農藥殘留,最低要求是:當 m/z > 200時,至少選擇2個離子;當 m/z > 100時,至少選擇3個離子。這個規定一般在多殘留(100種以上農藥)初篩時采用,最終定性還需再增加選擇離子個數或采用不同的色譜技術。

  7.鑒定依賴于診斷(特征)離子的正確選擇。分子離子和準分子離子([M+H]+,[M-H]-)是重要的診斷離子,只要有可能應包括在檢測和識別過程 中。在一般情況下,特別是對于單級質譜,應選擇質荷比值相對高的離子(如,至少 m/z > 100)。只是由于失去水或失去相同集團所產生的離子,即使有較高 m/z值也很少選用。特征同位素離子,如:多氯或溴同位素簇群,對定性鑒別很有幫助,但所選的診斷離子不應該全部來自同一個前體離子分子,必須再選擇來自 其它裂解得到的產物離子。最終診斷離子選擇取決于整個分析過程可能帶來的背景干擾。一個檢測方法的檢出限取決于所有選擇離子中信噪比最低的離子。所以,通 常實驗初期可以考慮多選幾個診斷離子,在實際檢測時發現某個診斷離子受到背景干擾時,將其去掉。

二、對疑似陽性結果的進一步分析

  嚴格遵照前節定性分析規則出具的檢測結果一般沒有問題了。但是,有些食品的基質很復雜,比如中藥、茶葉,這些樣品要是做多種農藥殘留的檢測,其本身就有 非常多與農藥分子量和結構接近的化合物,當采用低分辨的GC-MS-SIM僅選擇2、3個特征離子檢測時,會有很多來自基質的干擾物質。再比如動物源食品 中檢測禁用獸藥,其執行的最低要求執行限(MRPL)基本上都是小于1μg/kg,目前檢出限要求最低的是日本肯定列表規定的肉及肉制品中鹽酸克倫特羅 (瘦肉精),其檢出限為0.05 μg/kg,對于加工后的動物源食品,如:罐頭、香腸、烤串等又添加了許多調味料,這么復雜的體系卻又是如此低的檢出限,也常常會有來自基質或分析系統的 干擾物質。為了更準確定性,也是對出具結果的負責,往往需要再做進一步的確證。隨著質譜技術的發展,現在有多種技術手段可以對疑似陽性結果做進一步分析, 簡單的說,就是要提高確證的識別點數。目前常采用的方法有這樣一些:

  1.高分辨質譜法。根據歐盟指令規定,高分辨質譜的 分辨率必須≥10000。從前表可以看出,高分辨質譜離子的識別點數較之低分辨質譜要高,若選擇同樣的離子數,高分辨質譜的識別點數更高。過去GC可以與 磁質譜儀聯用,但是LC沒有與之較好匹配的質譜,滿足不了殘留獸藥分析。近年賽默飛(ThermoFisher)公司推出了四極桿/靜電場高分辨質譜儀 (Q Exactive,簡稱QE),可以與LC聯用(也可以與GC聯用)。LC-QE已經可以滿足最嚴苛殘留獸藥限量的檢測。(可參見我的博客《對高分辨質譜Q Exactive的性能測試及在食品中殘留物分析的應用》)。 同樣是選擇1個前體離子和2個產物離子,三重四極質譜(QqQ)的識別點數為4(1+1.5×2),而四極-高分辨質譜的識別點數為 7(2+2.5×2)。近幾年TOF-MS的檢測靈敏度也有不少提高,可以用于添加劑、農殘等項目的檢測,但做禁用獸藥檢測靈敏度還顯不夠。

  2.前體離子二級全譜法。QqQ 檢測時采用MRM掃描方式也是受到檢出限限制無奈的選擇。如果選擇前體離子碰撞后產生的二級質譜全譜定性,這時的檢測靈敏度根本無法滿足殘留獸藥檢出限量 要求。而通常選擇2個產物離子,靈敏度雖然提高了,但被測物分子信息卻丟了很多。Sciex公司推出了四極桿-線性離子阱質譜(QTrap),利用離子增 強功能(EPI),使二級質譜全譜的響應強度提高2個數量級以上,完整保留了被測物的分子信息,定性準確度大大提高。

  3.多級離子解析法。如 果二級產物離子比較強,還可以再進行一次碰撞,以三級產物離子作為最終判定離子。三級的2個特征產物離子和離子比都相同,而且還有相同的保留時間,其概率 非常低了。這時定性的識別點數至少是5.5(1+1.5+1.5×2)。現在有這種檢測功能的常用儀器有:Sciex公司的QTrap系列。另外,賽默飛 公司的線性離子阱-靜電場高分辨質譜(LTQ-Orbitrap)和島津公司的離子阱-飛行時間質譜(IT-TOF),不僅可以做多級,而且還是高分辨質 譜儀,不僅可以定分子量,還可以定結構,定性更加準確。但多級離子檢測時,每增加一次解離靈敏度都會有一定下降,所以,比較適合做含量相對高的添加劑、農 殘等項目檢測,不太適合做禁用殘留獸藥的檢測。

   總之,近年來國家對食品檢測實驗室投入了不少資金,現在食品檢測實驗室的硬件較之從前都有大幅提高,GC-MS和LC-MS/MS基本都已經是標配。今后再購置儀器時,應根據實驗室的主要工作合理配置儀器,使實驗室出具的數據更加可靠、準確。

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